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聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法

  聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法_医药卫生_专业资料。聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 发布时间:11-06-01 来源: 点击量:10032 字段选择:大 中 小 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方 法。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 发布时间:11-06-01 来源: 点击量:10032 字段选择:大 中 小 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方 法。 在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来 分离。 聚丙烯酰胺凝胶有以下优点: ①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和 N, N甲叉双丙烯酰胺聚合而成 的大分子。凝胶有格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物,没有或很少 带有离子的侧基,因而电渗作用比较小,不易和样品相互作用。 ②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质, 在聚合前可调节 单体的浓度比,形成不同程度交链结构,其空隙度可在一个较广的范 围内变化,可以根据要分离物质分子的大小,选择合适的凝胶成分, 使之既有适宜的空隙度,又有比较好的机械性质。一般说来,含丙烯 酰胺 7-7.5%的凝胶,机械性能适用于分离分子量范围不 1 万至 100 万物质,1 万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺 15-30%的凝胶,而分子 量特别大的可采用含丙烯酰胺 4%的凝胶,大孔胶易碎,小孔胶则难 从管中取出,因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺, 以改进凝胶的机械性能。 ③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。 凝胶无色透明, 易观察, 可用检测仪直接测定。 ④丙烯酰胺是比较纯的化合物,可以精制,减少污染。合成聚丙 烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体, 甲撑双丙烯酰胺称交联剂,在水溶液中,单体和交联剂通过自由基引 发的聚合反应形成凝胶。 在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中,需要有催化剂参加,催化 剂包括引发剂和另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基, 通过自由基的传递,使丙烯酰胺成为自由基,发动聚合反应,加速剂 则可加快引发剂放自由基的速度。 常用的引发剂和加速剂的配伍如下 表: 聚合反应催化剂配伍 引发剂 (NH4)2S2O8 (NH4)2S2O8 核黄素 加速剂 TEMED DMAPN TEMED 注:(NH4)2S2O8,过硫酸胺 TEMED:N,N,N,N;四甲基乙二胺 DMAPN:β -二甲基胺基丙晴 用过硫酸铵引发的反应称化学聚合 反应;用核黄素引发,需要强光照射反应液,称光聚合反应。聚丙烯 酰胺聚合反应可受下列因素影响:1、大气中氧能淬灭自由基,使聚 合反应终止,所以在聚合过程中要使反应液与空气隔绝。 2、某些材 料如有机玻璃,能抑制聚合反应。3、某些化学药物可以减慢反应速 度,如赤血盐。 4、温度高聚合快,温度低聚合慢。以上几点在制备 凝胶时必须加以注意。凝胶的筛孔,机械强度及透明度等很大程度上 由凝胶的浓度和交联决定。 100 亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂 每 的总克数称凝胶浓度,常用 T%表达;凝胶溶液中交联剂占单体和交 联体总量的百分数称为交联度,常用 C%表示,可用下式计算: 公式 a:丙烯酰胺克数; b:甲撑双丙烯酰胺克数;m:缓冲液体积(毫升) 凝胶浓度过高时,凝胶硬而脆,容易破碎;凝胶浓度太低时,凝胶稀 软,不易操作。 交联度过高,胶不透明并缺乏弹性;交联度过低,凝胶呈糊状。 聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度,它不防止对流减低扩散的能力,而 且因为它具有三度空间网状结构, 某分子通过这种网孔的能力将取决 于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状,这是凝胶的分子筛作用。 由于这种分子筛作用,这里的凝胶并不仅是单纯的支持物,因此,在 电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外, 还必须注意与凝胶本身有 关的各种性质(网孔的大小和形状等)。可通过下式计算来选择适当 的凝胶网孔。 公式 式中:P 为网孔平均直径,C 为多聚体浓度,d 为该多聚体分子 直径(若不是卷曲的分子应为 5A),K 为常数,K 值取决于涨胶的几 何构型,假如多聚体的链是以近似于直角交联的,则约为 1.5 根据此 式,我们可以通过多聚体浓度 C 近似地计算出网孔直径,例如已知多 聚体浓度为 5%,其网孔平均直径应为: 公式 这样的计算是粗略的,与实际情况有一定距离,有人测定了总浓 度(T)为 20%的丙烯酰胺液,在六种不同比例的双丙烯酰胺存在下, 聚合后的网孔大小,发现孔径与总浓度有关,总浓度愈大,孔径相应 变小,机械强度增强,与总浓度不变时,甲叉双丙烯酰胺(Bis)的浓 度在 5%时孔径最小,高于或低于此值时,聚合体孔径都相对变大, 凝胶孔径在凝胶电泳中是一个重要的参数, 它往往决定了电泳的分离 效果。 经过不断的实践, 得到了如表 3 所示的经验值, 在一般情况下, 大多数生物体内的蛋白质采用 7.5%浓度的凝胶,所得电泳结果往往 是满意的,因此称由此浓度组成的凝胶为“标准凝胶”。 对那些用于重要研究的凝胶,最好是通过采用 10%的一系列凝胶浓度 梯进行预先试验,以选出最适凝胶浓度。 表 3 不同分子量范围的蛋白质和核酸在凝胶电泳中所选用的凝胶浓度百分率 物质 蛋白质 分子量范围 101-4×10 4 5 适用的凝胶浓度(%) 5 4×10-1×10 1-5 5 20-30 15-20 10-15 5-102-5 ×10 5×10 核酸 4 4 5 5 10 10 -10 10 -2×10 6 10-20 5-102-3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类, 前者指整个 电泳系统中所用缓冲液,pH 值和凝胶网孔都是相同的,后者是指在 电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液,pH 值和孔径,不连续 电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层,从而提高分辨能力。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时, 它的迁移率取决于它所带净 电荷以及分子的大小和形状等因素。 如果加入一种试剂使电荷因素消 除,那电泳迁移率就取决于分子的大小,就可以用电泳技术测定蛋白 质的分子量。1967 年,Shapiro 等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠 (SDS)具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量 SDS 和巯基乙 醇,SDS 可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负 电,使各种蛋白质—SDS 复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大 大超过了蛋白质分子原的电荷量, 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的 电荷差别,SDS 与蛋白质结合后,还可引起构象改变,蛋白质—SDS 复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒,不同蛋白质的 SDS 复合物 的短轴长度都不一样,约为 18A,这样的蛋白质—SDS 复合物,在凝 胶中的迁移率,不再受蛋白质原的电荷和形状的影响,而取决于分子 量的大小, 因而 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子 量。 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 一、实验目的 1. 了解电泳实验原理 2. 掌握电泳实验操作规程 3. 用电泳方法测定蛋白分子量 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 二、实验原理 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornstein(1964) 和 Dav is(1964) 设计的,样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓 冲液含 Tris-甘氨酸(pH8.3), 分离胶中含 Tris-HCl(pH 8.8)。系统 中所有组分都含有 0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中 的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界, 在 移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推 动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处 pH 值较高,有利 于甘氨酸的离子化, 所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯 离子之后,沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后,SDS-蛋白质复合物 成一电位和 pH 值均匀的区带泳动穿过分离胶,并被筛分而依各自的 大小得到分离。 SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。 SDS-蛋白质复合物的 流体力学和光学性质表明,它们在水溶液中的形状,近似于雪茄烟形 状的长椭园棒,不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样(约为 1 8?,即 1.8nm),而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的 S DS-蛋白质复合物,在凝胶电泳中的迁移率,不再受蛋白质原有电荷 和形状的影响,而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。 由于 SDS 和巯基乙醇的作用,蛋白质完全变性和解聚,解离成亚 基或单个肽链,因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰 胺的浓度和交联度。 在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无 价值的粘稠溶液, 而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有 所增加,并形成 SDS 蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径 随 “双丙烯酰胺~丙烯酰胺” 比率的增加而变小,比率接近 1:2 0 时孔径达到最小值。SDS 聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺~丙 烯酰胺”为 1:29 配制,试验表明它能分离大小相差只有 3% 的蛋白 质。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径, 而孔径又是灌胶时所用丙烯酰 胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用 5~15%的丙烯酰胺所灌制凝胶 的线性分离范围如下表: SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 *丙烯酰胺浓度(%) 15 10 7.5 5.0 线 *双丙烯酰胺~丙烯酰胺摩尔比为 1:29。 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 三、实验材料和试剂 1. 试剂 (1)丙烯酰胺和 N, N’-亚甲双丙烯酰胺。以温热(利于溶解 双丙烯酰胺)的去离子水配制含有 29%(w/v)丙烯酰胺和 1%(w/v) N,N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液,丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程 中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸, 这一脱氨基反应是光催化或碱催化 的,故应核实溶液的 pH 值不超过 7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于 室温,每隔几个月须重新配制。 小心:丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附 于皮肤。 (2)十二烷基硫酸钠(SDS)。SDS 可用去离子水配成 10%(w /v)贮存液保存于室温。 (3)用于制备分离胶和积层胶的 Tris 缓冲液。 (4)TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)。TEMED 通过催化过 硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 (5) 过硫酸铵。 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合 所必需的自由基。须新鲜配制。 (6)1.5M Tris,pH8.8(分离胶缓冲液) (7)1M Tris,pH6.8(浓缩胶缓冲液) (8)Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 25mM Tris,250mM 甘氨酸 (pH 8.3),0.1% SDS, (9) 样品处理液, 50mM Tris-HCl(pH 6.8), 100mM DTT(or 5% 巯基乙醇),2% SDS,0.1% 溴酚蓝,10%甘油 (10)染色液: 0.1% 考马斯亮蓝 R250,40% 甲醇,10% 冰醋酸 (11)脱色液: 10% 甲醇,10% 冰醋酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 四、实验步骤 1. 配制 SDS 聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂 2.SDS 聚丙烯酰胺凝胶的灌制(realplay) ⑴根据厂家说明书安装玻璃板。 ⑵确定所需凝胶溶液体积, 按下表给出的数值在一小烧杯中按所 需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入 TEMED,马上 开始聚合,故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。 配制 Tris-甘氨酸 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液 溶液成分 6% 水 30%丙烯酰胺 1.5M Tris(pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 0.05ml 0.05ml 0.004ml 0.1ml 0.1ml 0.008ml 0.15ml 0.15ml 0.012ml 0.2ml 0.2ml 0.016ml 0.25ml 0.25ml 0.02ml 0.3ml 0.3ml 0.024ml 2.6ml 1.0ml 1.3ml 5.3ml 2.0ml 2.5ml 7.9ml 3.0ml 3.8ml 10.6ml 4.0ml 5.0ml 13.2ml 5.0ml 6.3ml 15.9ml 6.0ml 7.5ml 总体积 5ml 总体积 10ml 总体积 15ml 总体积 20ml 总体积 25ml 总体积 30ml 8% 水 30%丙烯酰胺 1.5M Tris(pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 10% 水 30%丙烯酰胺 1.5M Tris(pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 12% 水 30%丙烯酰胺 1.5M Tris(pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 15% 水 30%丙烯酰胺 1.5M Tris(pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 0.05ml 0.05ml 0.002ml 0.1ml 0.1ml 0.004ml 0.15ml 0.15ml 0.006ml 0.2ml 0.2ml 0.008ml 0.25ml 0.25ml 0.01ml 0.3ml 0.3ml 0.012ml 1.1ml 2.5ml 1.3ml 2.3ml 5.0ml 2.5ml 3.4ml 7.5ml 3.8ml 4.6ml 10.0ml 5.0ml 5.7ml 12.5ml 6.3ml 6.9ml 15.0ml 7.5ml 0.05ml 0.05ml 0.002ml 0.1ml 0.1ml 0.004ml 0.15ml 0.15ml 0.006ml 0.2ml 0.2ml 0.008ml 0.25ml 0.25ml 0.01ml 0.3ml 0.3ml 0.012ml 1.6ml 2.0ml 1.3ml 3.3ml 4.0ml 2.5ml 4.9ml 6.0ml 3.8ml 6.6ml 8.0ml 5.0ml 8.2ml 10.0ml 6.3ml 9.9ml 12.0ml 7.5ml 0.05ml 0.05ml 0.002ml 0.1ml 0.1ml 0.004ml 0.15ml 0.15ml 0.006ml 0.2ml 0.2ml 0.008ml 0.25ml 0.25ml 0.01ml 0.3ml 0.3ml 0.012ml 1.9ml 1.7ml 1.3ml 4.0ml 3.3ml 2.5ml 5.9ml 5.0ml 3.8ml 7.9ml 6.7ml 5.0ml 9.9ml 8.3ml 6.3ml 11.9ml 10.0ml 7.5ml 0.05ml 0.05ml 0.003ml 0.1ml 0.1ml 0.006ml 0.15ml 0.15ml 0.009ml 0.2ml 0.2ml 0.012ml 0.25ml 0.25ml 0.015ml 0.3ml 0.3ml 0.018ml 2.3ml 1.3ml 1.3ml 4.6ml 2.7ml 2.5ml 6.9ml 4.0ml 3.8ml 9.3ml 5.3ml 5.0ml 11.5ml 6.7ml 6.3ml 13.9ml 8.0ml 7.5ml ⑶迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶 所需空间(梳子的齿长再加 0.5cm)。 再在胶液面上小心注入一层水 (约 2~3mm 高),以阻止氧气进入凝胶溶液。 ⑷分离胶聚合完全后(约 30 分钟),倾出覆盖水层,再用滤纸 吸净残留水。 ⑸制备浓缩胶:按下表给出的数据,在另一小烧杯中制备一定体 积及一定浓度的丙烯酰胺溶液,一旦加入 TEMED,马上开始聚合,故 应立即快速旋动混合物并进入下步操作。 配制 Tris-甘氨酸 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5% 浓缩胶溶液 溶液成分 水 30%丙烯酰胺 1M Tris(pH6.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 0.03ml 0.03ml 0.003ml 0.04ml 0.04ml 0.004ml 0.05ml 0.05ml 0.005ml 0.06ml 0.06ml 0.006ml 0.08ml 0.08ml 0.008ml 总体积 3ml 2.1ml 0.5ml 0.38ml 总体积 4ml 2.7ml 0.67ml 0.5ml 总体积 5ml 3.4ml 0.83ml 0.63ml 总体积 6ml 4.1ml 1.0ml 0.75ml 总体积 8ml 5.5ml 1.3ml 1.0ml ⑹聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干 净的梳子。小心避免混入气泡,再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的 空隙,将凝胶垂直放置于室温下。 ⑺在等待浓缩胶聚合时,可对样品进行处理,在样品中按 1:1 体 积比加入样品处理液,在 100℃加热 3 分钟以使蛋白质变性。 ⑻浓缩胶聚合完全后(30 分钟),小心移出梳子。把凝胶固定 于电泳装置上,上下槽各加入 Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排 出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 ⑼按予定顺序加样,加样量通常为 10~25μ l(1.5mm 厚的胶)。 ⑽将电泳装置与电源相接,凝胶上所加电压为 8V/cm。当染料前 沿进入分离胶后,把电压提高到 15V/cm,继续电泳直至溴酚蓝到达 分离胶底部上方约 1cm,然后关闭电源。 ⑾从电泳装置上卸下玻璃板,用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一 孔(第一槽)凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。 3.用考马斯亮蓝对 SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行染色 经 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝 R2 50 染色。染色 1~2 小时或过夜。 4. 换脱色液脱色,需 3~10 小时,其间更换多次脱色液至背景清 楚。 此方法检测灵敏度为 0.2~1.0mg。脱色后,可将凝胶浸于水中, 长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录,可对凝胶进 行拍照,或将凝胶干燥成胶片。 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 五、结果处理 测量并计算分子量 蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式,经 37 种蛋白的测 定得到以下的关系式: Mw =K (10-bm) (1) lgMw = lg K -bm =K1-bm (2) 其中 Mw 是蛋白质分子量;K 和 K1 为常数 b 为斜率,m 是电泳迁移率,实际使用的是相对迁移率 mR。 如果用几种标准蛋白质分子量的对数作纵坐标,用各自的相对迁 移率作横坐标,即可画出一条斜率为负的标准曲线。相对迁移率为: 其中,dpr、dBPB 分别为样品和 BPB(溴酚兰)以分离胶表面为起点 迁移的距离。 欲求未知蛋白的分子量,只需求出它的相对迁移率: mR 未=dpr 未/dBPB 然后,从标准曲线上就可求出此未知蛋白的分子量。 取出脱色后的凝胶平放在两块透明投影胶片中间,赶尽气泡,在 复印机上复印。 在复印的凝胶图上用直尺分别量出各条蛋白带迁移的 距离 dpr 和 dBPB(以蛋白带的上沿或中心为准),计算相对迁移率,根 据方程式: lgMw = K1-bmR 用各标准蛋白分子量的对数 (纵坐标) 和相对迁移率 m(横坐标) R 画出标准曲线, 由标准曲线再求出其他各条待测和未知蛋白带的分子 量,如有可能计算其误差 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳--生物秀 PCR 技术 【实验试剂和器材】 (一)试剂 1. 制备分离胶、浓缩胶有关试剂 (1)凝胶贮液:在通风橱中,称取丙烯酰胺 29g,甲叉双丙烯酰胺 1 g,加重蒸水溶解后,定容到 100ml。过滤后置棕色瓶中,4℃保存, 一般可放置 1 个月。 (2)pH8.9 分离胶缓冲液: Tris36.3g ,加 1mol/L HCl 48ml,加 重蒸水 80ml 使其溶解,调 pH8.9,定容至 100ml, 4℃保存。 (3)pH6.7 浓缩胶缓冲液: Tris5.98g ,加 1mol/L HCl 48ml,加 重蒸水 80ml 使其溶解,调 pH6.7,定容至 100ml, 4℃保存。 (4)TEMED(四乙基乙二胺)原液 (5)10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制) 2.pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液 称取 Tris6.0g,甘氨酸 28.8g,加蒸馏水约 900ml,调 pH8.3 后,用 蒸馏水定容至 1000ml。置 4℃保存,临用前稀释 10 倍。 3. 50%(v/v)甘油 4. 1%(w/v) 溴酚蓝:称取 100mg 溴酚蓝,加蒸馏水 10ml,搅拌直到 完全溶解,过滤除去聚合的染料。 5.5×样品缓冲液(loadingbuffer):10ml 3.1ml1mol/L Tris-HCl(pH6.7) 5ml 50%(v/v)甘油 0.5ml1% (w/v) 溴酚蓝 1.4ml 蒸馏水 4. 考马斯亮蓝 G250 染色液:称 100mg 考马斯亮蓝 G250,溶于 200m l 蒸馏水中,慢慢加入 7.5ml 70%的过氯酸,最后补足水到 250ml,搅拌 1 小时,小孔滤纸过滤。 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法 312.5mmol/L 25% 0.05%

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