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05 生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清

  05 生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质_生物学_自然科学_专业资料。长治医学院生物化学实验报告。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质 【目的】 1 . 掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。 2 .熟悉 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。 【原理】 带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动,称为电泳。聚丙烯酰 胺凝胶电泳( PAGE )就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时, 蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小,形状和所带的电荷量有关。 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶,是由丙烯酰胺( Acr )单体和少量交 联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺 Bis ) ( 在催化剂 过硫酸铵 Ap ) 和加速剂 四 ( 甲基乙二胺( TEMED ) 的作用下发生聚合反应而制得的(其化学结构式见第 2 篇第 1 章)。 聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构, 其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度 或单体与交联剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小,学生实验一般 选用 7 %聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、 分子筛效应和电荷效应的三重作用分 离物质(见第 2 篇第 1 章), 使样品分离效果好, 分辨率较高。一般醋酸纤 维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ~ 7 条带, 而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能 分离出十几条到几十条来(图 3-4 ),是 目前较好的支持介质, 应用十分广 泛。 图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 根据凝胶支持物的形状不同,分为垂直板电泳和盘状电泳两种,二者原理相同。 本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中, 以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶 作为支持物, 采用电泳基质的不连续体系, 使样品在不连续的两相间积聚浓缩 (浓 缩效应)成厚 度 为 10 -2 cm 的起始区带,然后再利用 分子筛效应和电荷效 应的双重作用在分离胶中 进行电泳分离。 【器材】 1 .电泳仪 直流稳压电源,电压 400 ~ 500V ,电流 50mA 。 2 .垂直管型圆盘电泳装置 目前这类装置的种类很多, 可根据不同的实验要求选择其中的一种。这类装置均 由两个基本的部分组成, 一部分为载胶玻璃管, 须选用内径均匀 5 ~ 6mm ) , ( 外径 7 ~ 8mm ,长 80 ~ 100mm 的玻璃管作为材料,也可以使用更细的玻璃 管。另一部分为电泳液槽,可分为上下两槽 。电泳时,上下两槽通过凝胶柱沟 通电流(图 3-5 )。 图 3-5 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A 为正面, B 为剖面 ) 3 .大号试管和中号试管 4 .微量移液器 5 . 5ml 注射器和 9 号注射针头 6 .洗耳球、滤纸条、封口膜等 【试剂】 1 .丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 一般性的分析工作,用分析纯的 Acr 和 Bis 即可,精细的分析工作,尤其是分 子量的测定和定量分析,需商品 Acr 和 Bis 进行重结晶,进一步纯化。 2 . N , N , N ', N ' — 四甲基乙二胺( TEMED ) 商品 TEMED 即可,低温,避光保存。 3 . 10% 过硫酸铵溶液( AP , W/V ) 10g 过硫酸铵定容到 10ml ,最好使用新鲜配制的溶液。 4 .染色液 取三氯乙酸 200 g 加水 500ml ,然后加入 10 g 考马斯亮蓝 R 250 用玻璃棒 搅拌,待完全溶解后,再加入蒸馏水加至 1000ml 。 5 .脱色液的配制 取三氯乙酸 100 g 加蒸馏水溶解后加至 1000ml 。 6 .储备液的配制 电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表: Tris 5.98g 缓冲液 浓缩胶 凝胶储液 1mol/L HCl 48ml 加蒸馏水至 100ml Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml Tris 36.3g 缓冲液 分离胶 凝胶储液 1mol/LHCl 48ml 加蒸馏水至 100ml Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml PH 8.9 PH 6.7 Tris 6g 10 × 电极缓冲液 Gly 28.8g 加蒸馏水至 1000ml 储液配制好后放冰箱 4 ℃ 冷藏备用,用时 10 倍稀释,学生用时大约 3 天需 更换一次。 7 .凝胶液的配制 分离胶和浓缩胶的配制见下表: 7% 分离胶配制( ml ) 双蒸水 13.5 凝胶储液 7 PH 8.9 缓冲液 7.5 1%TEMED 2 总体积 30 8 . 20% 蔗糖 100ml 取蔗糖 20g ,加少许蒸馏水溶解,最后加至 100 ml 。 9 .加样缓冲液的配制 ( PH6.7 ) 取 1mol 盐酸 4.8 ml , Tris 0.6g , 20% 蔗糖溶液 40ml ,加水至 80ml 充 分混匀后,再加入 0.02g 溴酚蓝, 4 ℃ 保存备用。 【操作】 1 .凝胶系统的聚合和制备 一般先制备分离胶,然后再在分离胶上面制作浓缩胶。 ( 1 )电泳玻璃管的准备 取一根洁净的电泳玻璃管, 垂直放在青霉素瓶盖的凹穴中或用封口膜密封, 备用。 ( 2 )分离胶(小孔胶)的制备 取分离胶 3ml 放入试管,加入 100μ l 10% Ap 溶液混匀后使用。 3% 浓缩胶配制( ml ) 双蒸水 5.7 凝胶储液 1 PH 6.7 缓冲液 1.3 1%TEMED 2 总体积 10 PH 8.3 用微量移液器抽取胶液小心迅速加入到玻璃管内, 当加到液面距离电泳玻璃管上 口 2cm 时停止(约 1.6ml )。注意在加的过程中不要混进空气,用过的注射器 和针头要及时用水清洗,防止堵塞。 再在其上面小心覆盖 0.5cm 高的蒸馏水层(约 0.2ml )以隔绝空气,并防止柱 表面的弯月面。加水过程中不要用力过猛,防止将液面胶液冲起。刚加入水层时 在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面,此折光面会逐渐消失,等再次出现 时标志分离胶聚合已经开始,应使玻璃管垂直静置约 15~20 分钟后,完成凝胶 的聚合过程。然后用滤纸小心吸去表面的水层,切勿破坏胶面的完整性。 ( 3 )浓缩胶(大孔胶)的制备 取浓缩胶 1ml 放入试管,加入 50μ l 10%Ap 溶液混匀后使用。 用微量移液器吸取少量浓缩胶缓冲液漂洗一下分离胶的胶面, 用滤纸吸取残留的 缓冲液,滤纸尽量不要接触胶表面。 再加入约 1cm 高的浓缩胶(约 0.25ml ),表面也覆盖一层蒸馏水。刚加入水 层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面,此折光面会逐渐消失,等再次 出现时标志浓缩胶聚合已经开始,聚合 20~30 min 后除去上面的水层,同样不 要破坏胶面的完整性。 吸去水层后用电泳缓冲液漂洗胶面,再用电泳缓冲液注满至管口,在室温下放置 10~20 min 后即可使用了。 2 .样品的制备和点样 ( 1 )样品的准备:取兔血清 0.5ml ,加入 3ml 加样缓冲液混合。可在 4 ℃ 冰箱保存 2 周。 ( 2 )点样:将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧,防止电泳中产生漏 液。 然后分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液,下槽的液面应没过玻璃管 的下管口(注意不要有气泡存在)和电极丝;上槽的液面应没过玻璃管口 0.5~ 1cm 。用微量注射器吸取 50μ l 样品;标准蛋白样品 1 份(蛋白质含量 1mg/ml ,溶于加样缓冲液中)小心的加入玻璃管内,注意不要让样品溢出管口。 4 .电泳 ( 1 )电流电压条件 圆盘电泳:直流稳流电流强度通常为 4mA/ 管 。 ( 2 )电泳时间 一般约需 3 小时。样品中溴酚蓝电泳至距分离胶前缘约 1cm 处时即可停止电 泳。 5 .剥胶 电泳结束后,取下玻璃管,用带长针头的注射器(内盛蒸馏水)从浓缩胶一端紧 贴玻璃管壁缓慢插入针头, 一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管。靠水流的压力 和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开,待水流从另一端流出时,再慢慢将针头 退出(注意操作中不要把胶条搅碎)。然后用洗耳球轻轻在胶管的一端加压,将 胶条从玻璃管中缓慢滑出。 6 .染色和脱色 剥胶完毕后,将胶条放入染色液中过夜( 16 小时以上)。 将胶条以自来水冲 洗两次,然后在脱色液中脱色约 5 分钟,共两次。 7 .结果分析 脱色完全后,从脱色槽中取出凝胶(小心折断或撕裂),观察区带的数量及迁移 率。如果需定量,可进行区带扫描,计算出各区带中蛋白质的含量。 【注意事项】 1 .制胶时必须以封口膜将管下口封严密,加 AP 后立即灌胶。 2 .灌凝胶时不能有气泡,以免影响电泳时电流的通过。 3 .电泳时,电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错,以免样品反方向泳动,电泳 时应选用合适的电流、电压,过高或者过低都会影响电泳效果。 4 .电泳时,为保证电泳结果满意,最好使用新稀释的缓冲液。 5 .丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂,对皮肤有刺激作用,操作时宜带 手套,纯化应在通风柜中进行。 【思考题】 1 . 聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物,有何优缺点? 2 . 哪些因素可以影响凝胶的聚合? 3 . 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的 40 %蔗糖溶液?蔗糖及溴酚蓝各有 何用途? 附: 1 . 不同浓度 聚丙烯酰胺 凝胶的配制,见表 3 -2 。 表 3-2 不同浓度 聚丙烯酰胺 凝胶的配制 分离胶浓度 试剂名称 分离 胶 浓缩 胶 储备液 缓冲液 储备液 配制 30ml 不同浓度分离胶液所需试剂量( ml ) 7% 7 7.5 ----2 10% 10 7.5 ----2 12% 12 7.5 ----2 15% 15 7.5 ----2 20% 20 7.5 ----2 配制 10ml 3% 浓缩胶 1.0 1.25 2 缓冲液 1%TEMED 蒸馏水 13.3 10.3 8.3 5.3 0.3 5.65 以上各液加入后, 为了去除抑制凝胶聚合的氧, 在加入 Ap 之前应进行抽气处理。 10% 过硫酸胺 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 2 .几种染料的性能及染色原理 ( 1 )氨基黑 10B(amino black 10B) C 22 H 13 O 12 N 6 S 3 Na 3 , MW=715,λ max=620 ~ 630mm 。氨基黑是酸 性染料,其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。北京快3缺点是灵 敏度不太高,对 SDS— 蛋白质染色效果不好,对不同的蛋白质着色度不同,色 调不一(有蓝、黑、棕等)。 ( 2 )考马斯亮蓝 R 250 (Comassie brilliant blue R 250 ) : C 45 H 44 O 7 H 3 S 2 Na , MW=824 , λ max=560 ~ 590mm ,原理与氨基 黑相似,灵敏度比氨基黑高 5 倍。尤其适用于 SDS 电泳微量蛋白质染色。但蛋 白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白质的染色不合乎 Beer 定律。 ( 3 )考马斯亮蓝 G 250 : 比考马斯亮蓝 R 250 多 2 个甲基, MW=854 , λ max=590 ~ 610mm 。染色的 灵敏度不如 R 250 ,但比氨基黑高 3 倍,优点在于它在三氯乙酸中不溶解成胶 体, 能选择地染蛋白质而几乎无本底色。所以常用于需重复性染色和稳定性的染 色,适于定量分析。 聚丙烯酰胺不连续盘状电泳和垂直板电泳基本原理是相同的。 后者适用于需要对 比性分析的样品的电泳分析。这项电泳技术( PAGE )由于能够使样品区带浓缩 变窄,所以分辨力高、设备简单、样品量小( 1 ~ 100μ g );时间短,操作 方便,可分离生物大分子的分子大小范围广泛,可结合 SDS 后进行亚基分析和 分子量测定。这种方法目前几乎代替了超速离心沉降法。 PAGE 的用途较广, 对生物大分子能进行分离、 定性、 定量分析, 又能用于制备 mg 水平的材料 。 3 .蛋白质染色方法(表 3-3 ) 表 3-3 蛋白质染色方法 方 法 固 定 液 染 色 时 间 脱 色 5% 5 min (室温) 乙 醇, 过 0.1mol/L 氢氧化钠 - 1% 2 h (室温) 夜 氨基黑 或 7% 乙 或 7% 乙酸 - 1% 氨基黑 10min 酸, 过 ( 96 ℃ ) 夜 10% 20% 三氯乙酸 -1%R 250 过夜 三氯 乙酸 甲醇 - 水 - 浓 10 min (室 氨水 20% 乙酸 - 1%G 250 温) 64 ∶ 36 ∶ 1 染 液 甲醇或 氨基黑 10B 7% 乙酸 考马斯亮蓝 R 250 10% 三氯乙 酸 考马斯亮蓝 G 250 10% 乙酸

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