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聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质

  聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质_生物学_自然科学_专业资料。实验原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联 剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8,AP) 的作用 下聚合交联成三维

  实验原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联 剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8,AP) 的作用 下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支 持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。 TEMED(加速剂) 过硫酸铵 硫酸根自由基(催化剂) Acr (双链) Acr(长链) +Bis(交联剂) PAG凝胶 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构,具有 电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。 电荷效应 (电泳物所带电荷的差异性) 浓缩效应 (四个不连续性形成) 分子筛效应(凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致) ? 不连续体系由凝胶层、缓冲液离子成分、电位梯度、pH因素所组成。浓 缩胶是大孔径,分离胶是小孔径;Cl-为快离子、甘氨酸根离子为慢离子、 Tris为缓冲配对离子,Cl-PrGly-;浓缩胶缓冲液为pH6.7 ,分离胶缓冲 液为pH8.9 ;电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液; 电位梯度的差异 是自动形成的,北京快3。在快离子与慢离子之间形成电位梯度,由于Pr的有效迁 移率介于快慢离子之间故也就聚集在这个移动的界面附近,被浓缩成狭 小的中间层;2种孔径的凝胶、3种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成 了,样品得到浓缩。 样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性: (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性; ? 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子:HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子或慢离子:甘氨酸根 ? 当进入pH8.9的分离胶时,甘氨酸解离度增加,其有 效迁移率超过蛋白质; (c)电位梯度的不连续性: ?分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定 孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同 的迁移率,这就是分子筛效应。 ?电荷效应 电荷量不同,迁移率不同。 实验仪器 ? 电泳装置 稳压电源 盘状电泳槽 ? 玻璃管和橡胶帽 ? 刻度吸量管 ? 微量移液器 ? 培养皿 ? 注射器和长针头 ? 脱色摇床 实验试剂 ? 丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis) ? Acr的重结晶 ? Bis重结晶 (注意固体Acr和Bis应贮存应贮存棕色瓶中, 在干燥、低温和暗处保存,并注意避免超声波、 γ -辐射和自然光的照射) ? TEMED-四甲基乙二胺,避免冰箱保存。 ? 过硫酸铵(不能潮解,否则不能用) ? 染色液:用0.05N NaOH配制0.1%溴酚兰液 ? 洗脱液:7%醋酸 ? 其他试剂:见下表贮存液的配制。按表1配制各 贮存液置冰箱中贮存,可放1—2月(但过硫酸 铵液贮存冰箱不能超过一周)。 贮存液 1 2 3 4 5 6 100ml溶液中的含 量 1N HCl 48.0ml Tris 36.6克 TEMED 0.23ml Acr 28.0克 Bis 0.725克 过硫酸铵 0.14克 1N HCl 48.0ml Tris 5.98克 TEMED 0.46ml Acr 10.0克 Bis 2.5克 蔗糖 40.0克 pH 工作溶液配制的体积比 分离胶制备: 1份1号,2份2号,1份水 ; 8.9 抽气后加入4份3号 凝胶浓度 7% pH 8.9 浓缩胶制备: 1份4号,2份5号 6.7 抽气后加入4份6号 凝胶浓度 2.5% pH 6.7 实验步骤 ? 1、准备 ? 每人取电泳管1支,标好号码,并在距电泳管下端 7cm和7.5cm处画横线 滴蔗糖溶液后,套在电泳管底端。 2、制胶:取小烧杯2个,按表加液 试剂 分离胶溶液 (ml) 分离胶缓冲溶液( pH8.9)1.25 浓缩胶缓冲溶液(pH6.7) — 单体交联剂 2.5 DDW 6.19 催化剂(10%AP) 0.10 TEMED 0.02 成胶时间 30min 浓度 7.5%(孔小) 浓缩胶溶液 (ml) — 1. 25 1.0 7.65 0.10 0.02 15min 3%(孔大) ? 3. 灌柱 ⑴按上述操作,把分离胶溶液混匀,用滴管将分离胶溶液加 入到电泳管中,高至7cm处。然后在胶面上沿管壁缓缓注入 0.5cm高的水层,切勿打乱凝胶液面,静置30min左右。 ⑵待分离胶成胶后,用细滤纸条吸干上层水分,灌浓缩胶至 7.5cm处,再小心沿管壁加DDW高约0.5cm,静置15min 左右。 ⑶该浓缩胶成胶后,弃去上层水分,拔出橡胶帽。 4、样品液制备: ? 血清:0.1ml ? 40%蔗糖:0.1ml ? 0.05%溴酚兰:0.1ml 于一0.5mlEP管中混匀备用 5、装电泳管: ? 先将电泳缓冲液倒入下槽,再将电泳管装到电 泳槽内,用电泳缓冲液灌满胶管底部空隙,排 净空气,注意对称放置,使其散热均匀。最后 将上槽灌满缓冲液,排净电泳管里的气泡。 6、上样:用微量加样器吸样品液10ul,加 在浓缩胶上正中央。 ? 7、电泳: ? 上槽——负极 下槽——正极 ? 电流:先浓缩胶:1.5mA/管 然后分离胶:3.0mA/管 ? 8、剥胶 电泳毕,取下电泳玻管,用一长针头注射器(针 头长约6~8厘米),吸满蒸馏水为润滑剂,将 针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间,缓缓旋 转玻管,一边注水,一边使针头慢慢呈螺旋式 推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压 力,就可将凝胶柱压出玻管。 9、 固定和染色: 先用固定液固定5分钟,再在培养皿中装染色液,摇床染色 10min。 10、脱色: 加7%冰醋酸摇床脱色,三次,每次2~3min,一周之后观 察结果。 11、定量: 光密度扫描仪定量。 实验结果 — ?观看结果,描出血清电 泳区带图谱,确定清蛋白 有无异常。 + 注意事项 ? 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂, 对皮肤有刺激作用,注意避免直接接触。

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