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血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳

  血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳_生物学_自然科学_专业资料。血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳 PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) pp61 目的与要求: 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离混合蛋白质的原理;熟悉聚丙 烯酰

  血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳 PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) pp61 目的与要求: 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离混合蛋白质的原理;熟悉聚丙 烯酰胺凝胶电泳的实验方法和操 作技术。 操作步骤 ?制备凝胶 ?安装凝胶管 ?加样(血清样品 15-20μL 、其中含甘油、 溴酚兰) ?电泳(3mA/管) ?剥胶 ?染色和脱色 实验原理: ? 聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙 烯酰胺在催化剂作用下,聚合交联而成,具有网状 立体结构的凝胶,并以此为支持物在垂直的玻璃管 中进行电泳,电泳分离的区带类似圆盘状故命名为 圆盘电泳。 - + 结果 ◆聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续电泳和不连续电泳两类 ◆连续电泳指整个电泳系统中所用缓冲 液,pH值和凝胶网孔的 孔径都是相同的。 ◆不连续电泳是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲 液,pH值和孔径。 不连续圆盘电泳的凝胶管中置有两种 不同的凝胶层:浓缩胶、分离胶。 ?具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。 不连续电泳能使稀的样品在电泳过程 中浓缩成层,从而提高分辨能力 浓缩胶的浓缩效应 电极缓冲液:Tris-Gly 溶液(pH 8.3) 浓缩胶缓冲液: Tris-Cl 溶液(pH 6.7) 分离胶缓冲液: Tris-Cl 溶液(pH 8.9) 溶液中主要的负离子: pI : 血清蛋白质(5.0左右) 甘氨酸(5.97) 以及完全解离的Cl离子 形成先导离子(快离子)、尾随离子(慢离子) 在缓冲系统中的弱酸,如甘氨酸,在pH6.7时很少解离,其有效泳动速 率很低,而氯离子却有很高的泳动速率,蛋白质的泳动速率介于两者之间。 加上电压以后,作为先导离子的氯离子和尾随离子的甘氨酸离子分离开来, 并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强度成反比,这 一区带便获得较高的电压梯度,加速甘氨酸离子的泳动,使其赶上氯离子, 建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速率乘积相等的稳定态,使这些带 电颗粒以相同的速度泳动,两种离子之间有明显的边界。当甘氨酸、氯离子 界面通过样品进入浓缩胶时,在移动界面前有一低电压梯度,界面后有一高 电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质分子泳动速率比氯离子低,因此氯离 子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中,其泳动速率比 甘氨酸快。因此,移动的界面将蛋白质分子堆积到一起,形成一条狭窄的区 带。由于浓缩胶为大孔凝胶,故对蛋白样品没有分子筛作用。当移动的界面 到达浓缩胶和分离胶的界面时,凝胶的pH明显增加,导致甘氨酸大量解离。 此时,甘氨酸的有效泳动速率明显增加,超越蛋白分子,直接在氯离子后移 动。由于凝胶孔径变小,蛋白质分子的迁移速率降低,落在后面的蛋白质便 在均一的电压梯度和pH环境中泳动,并根据其固有的电荷与分子大小进行分 离。 可见,甘氨酸并非作为缓冲成分参与,而是作为尾随离子来参与电泳过程。 P26 操作步骤 ?制备凝胶 ?安装凝胶管 ?加样(血清样品 15-20μL 、其中含甘油、 溴酚兰) ?电泳(3mA/管) ?剥胶 ?染色和脱色 分离胶 制备凝胶 浓缩胶(过硫酸铵后加) 1%AP:过硫酸铵(引发剂) 1%TEMED:四甲基乙二胺(催化剂) ◆引发剂在凝胶形成中提供自由基,通过自由基的传递, 使丙烯酰胺成为自由基,导致聚合反应。 ◆催化剂则可加快引发剂产生自由基的速度。 注意事项: ?丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神 经毒性,避免呼吸道吸入和皮肤接触。 ?电泳注意用电安全。 操作步骤 ?制备凝胶 ?安装凝胶管 ?加样(血清样品 15-20μL 、其中含甘油、 溴酚兰) ?电泳(3mA/管) ?剥胶 ?染色和脱色

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